Western Blot 實(shí)驗(yàn)應(yīng)該注意什么？
來(lái)源：本站 作者：jiyuanbio 時(shí)間：2025/2/19
Western Blot 實(shí)驗(yàn)是什么？
Western Blot 實(shí)驗(yàn)，又叫蛋白質(zhì)免疫印跡，是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實(shí)驗(yàn)方法，在蛋白質(zhì)分析領(lǐng)域占據(jù)著舉足輕重的地位 。它就像是蛋白質(zhì)世界里的 “超級(jí)偵探”，能夠從復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物中精準(zhǔn)地找出目標(biāo)蛋白。
在科研的眾多領(lǐng)域，比如生物醫(yī)學(xué)研究中，科學(xué)家們想要了解某種疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)變化，或者在藥物研發(fā)中，探究藥物對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)的影響，Western Blot 實(shí)驗(yàn)都能大顯身手。它主要有兩大關(guān)鍵作用，一是定性分析，判斷目標(biāo)蛋白是否存在；二是半定量分析，比較不同樣本中目標(biāo)蛋白表達(dá)量的相對(duì)高低 。比如在研究腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的差異時(shí)，通過(guò) Western Blot 實(shí)驗(yàn)，就能知道某些與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的蛋白質(zhì)在兩種細(xì)胞中的表達(dá)情況，是腫瘤細(xì)胞中表達(dá)量升高，還是正常細(xì)胞中表達(dá)量更高，從而為腫瘤的診斷和治療提供重要線索。
樣本制備：實(shí)驗(yàn)的基石
樣本制備是 Western Blot 實(shí)驗(yàn)的開(kāi)篇之作，其重要性如同基石之于高樓。這一步驟的成功與否，直接關(guān)系到后續(xù)實(shí)驗(yàn)?zāi)芊耥樌M(jìn)行。只有制備出高質(zhì)量的樣本，才能為后續(xù)的蛋白質(zhì)分析提供可靠的基礎(chǔ)。
在樣本制備過(guò)程中，裂解液的選擇是首要關(guān)鍵。不同的蛋白質(zhì)定位需要不同的裂解液，就像不同的鎖需要不同的鑰匙。比如，對(duì)于全細(xì)胞蛋白的提取，NP-40、Triton X-100 或 RIPA 裂解液較為常用；而細(xì)胞質(zhì)（可溶）蛋白，Tris-HCl 裂解液更為合適 。一旦樣品開(kāi)始裂解，蛋白降解、去磷酸化和變性也隨即開(kāi)始，所以樣本裂解過(guò)程中要全程保持低溫（冰上或 4℃），所使用的試劑和耗材要提前預(yù)冷，并且裂解前幾分鐘要向裂解緩沖液中加入合適的酶抑制劑來(lái)減緩這些反應(yīng)。
樣本制備還有諸多注意事項(xiàng)。裂解液緩沖液 pH 值要合適，一般采用接近生理 pH 的緩沖液，如 Tris-HCl、PBS 等，pH 值太低或太高都有可能引起蛋白的變性、析出。蛋白提取時(shí)盡量保證不同樣品的鹽濃度一致，鹽離子濃度不一致會(huì)導(dǎo)致蛋白條帶寬窄不一；同時(shí)裂解液的鹽離子濃度不能太高，一般采用接近生理狀態(tài)的鹽離子濃度，防止蛋白鹽析；樣本鹽濃度比較高還會(huì)導(dǎo)致蛋白往兩邊擴(kuò)散，使得條帶越來(lái)越寬，最后條帶連在一起；也可能會(huì)導(dǎo)致泳道內(nèi)部電流偏大，最后出現(xiàn)笑臉的條帶。根據(jù)目的蛋白定位選擇合適的去垢劑裂解液，常見(jiàn)的去垢劑有 Triton X-100、NP40、SDS 等，不同的裂解液提取強(qiáng)度不同，其中 SDS 及其他離子型去垢劑的裂解液溶解能力最強(qiáng)，最有可能獲得最高的得率，但是會(huì)破壞蛋白 - 蛋白之間的相互作用，不適合 Co-IP 或者 Pull down 這類實(shí)驗(yàn)，如果想盡量保護(hù)蛋白 - 蛋白相互作用，避免蛋白變性，需要選擇溫和的非離子型去垢劑（例如 Triton X-100），或者直接用 Tris-HCl，PBS 這類不含去垢劑的緩沖液借助物理破碎提取可溶蛋白 。提取的樣本要盡可能新鮮，裂解前幾分鐘加相應(yīng)的酶抑制劑，提取時(shí)間要充足，提取全過(guò)程要保持低溫操作，使用的試劑和耗材要提前遇冷，提取后的樣本保存過(guò)程中要避免多次反復(fù)凍融。
凝膠制備：打造優(yōu)質(zhì)分離平臺(tái)
凝膠制備是 Western Blot 實(shí)驗(yàn)中至關(guān)重要的一環(huán)，它直接關(guān)乎到蛋白質(zhì)的分離效果，就如同搭建舞臺(tái)，只有舞臺(tái)搭建得穩(wěn)固、合適，后續(xù)的 “表演”（蛋白質(zhì)分離與檢測(cè)）才能精彩呈現(xiàn)。
在制備凝膠時(shí)，均一膠的制備尤為關(guān)鍵。要確保凝膠濃度均勻一致，這需要在配制過(guò)程中充分?jǐn)嚢韪鞣N試劑，讓它們完美融合。不同濃度的凝膠適用于不同分子量范圍的蛋白質(zhì)。低濃度的凝膠（如 5%），就像寬敞的大道，更適合大分子量的蛋白質(zhì)（大于 200 kDa）在其中遷移；中等濃度的凝膠（10%-12%）則像是城市里的主干道，通常用于分離中等分子量范圍的蛋白質(zhì)（25-200 kDa）；而高濃度的凝膠（15% 或更高）如同狹窄的小巷，適合分離小分子量的蛋白質(zhì)（小于 25 kDa） 。比如，當(dāng)我們研究的目標(biāo)蛋白是分子量較大的膠原蛋白時(shí)，就需要選擇低濃度的凝膠，讓它能夠在凝膠中順利遷移，與其他雜質(zhì)蛋白分離開(kāi)來(lái)。
在制膠過(guò)程中，AP（過(guò)硫酸銨）和 TEMED（四甲基乙二胺）的用量控制是一個(gè)要點(diǎn)。AP 是引發(fā)劑，TEMED 是加速劑，它們共同作用促使丙烯酰胺聚合形成凝膠。用量過(guò)多，凝膠會(huì)迅速聚合，可能導(dǎo)致凝膠不均勻，還會(huì)產(chǎn)生過(guò)多的自由基，對(duì)蛋白質(zhì)造成損傷；用量過(guò)少，聚合速度過(guò)慢，甚至可能無(wú)法聚合。聚合時(shí)間的把控也不容忽視。聚合時(shí)間過(guò)短，凝膠未完全凝固，在后續(xù)電泳過(guò)程中容易變形，影響蛋白分離效果；聚合時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，凝膠會(huì)變脆，同樣不利于實(shí)驗(yàn)進(jìn)行。一般來(lái)說(shuō)，在室溫下，凝膠的聚合時(shí)間在 30 分鐘到 1 小時(shí)左右，不過(guò)具體時(shí)間還需根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整。制膠時(shí)要隔絕氧氣，因?yàn)檠鯕鈺?huì)抑制凝膠的聚合，所以在灌膠后，通常會(huì)在膠液表面覆蓋一層水或異丙醇，形成一個(gè)無(wú)氧的環(huán)境，助力凝膠順利聚合。
電泳：蛋白分離的關(guān)鍵環(huán)節(jié)
電泳是 Western Blot 實(shí)驗(yàn)中分離蛋白的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，它就像是一場(chǎng)精彩的賽跑，不同分子量的蛋白質(zhì)在電場(chǎng)的驅(qū)動(dòng)下，在凝膠這個(gè) “跑道” 上展開(kāi)激烈角逐，從而實(shí)現(xiàn)分離。
在進(jìn)行上樣與電泳時(shí)，諸多要點(diǎn)需要牢記。為了實(shí)時(shí)觀察電泳進(jìn)程，判斷蛋白分子量大小，同時(shí)檢驗(yàn)轉(zhuǎn)膜效果，使用預(yù)染蛋白 Marker 是個(gè)不錯(cuò)的選擇。比如，在研究某種未知蛋白質(zhì)時(shí)，通過(guò)預(yù)染蛋白 Marker，就能直觀地看到不同分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白在凝膠中的遷移位置，從而推測(cè)出未知蛋白的分子量范圍 。
上樣時(shí)，要盡量保證每個(gè)泳道的蛋白量一致，體積也盡量相同。這就好比給每個(gè)參賽選手提供相同的裝備和資源，讓比賽更加公平。如果蛋白量差異過(guò)大，就像有的選手負(fù)重過(guò)多，有的選手則輕裝上陣，會(huì)導(dǎo)致條帶的亮度和寬度出現(xiàn)明顯差異，影響后續(xù)的分析判斷。一般來(lái)說(shuō)，對(duì)于全細(xì)胞裂解液，上樣量在 20 - 50 μg 較為合適；對(duì)于純化的蛋白，上樣量可以在 1 - 5 μg 。
如果有空置的泳道，一定要用等體積的 1x Loading Buffer 補(bǔ)齊，這一小小的舉動(dòng)卻有著重要作用。它能平衡電場(chǎng)，防止電場(chǎng)不均勻?qū)е伦詈蟮囊粌蓚€(gè)樣品條帶上揚(yáng)，就像給天平的兩端放上相同重量的砝碼，讓天平保持平衡。
在電泳過(guò)程中，也可能會(huì)遇到一些問(wèn)題。比如，電壓過(guò)高，蛋白質(zhì)在凝膠中跑得過(guò)快，就像賽跑選手速度過(guò)快，容易失控，可能會(huì)導(dǎo)致條帶變形、分辨率降低；電壓過(guò)低，電泳時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，不僅浪費(fèi)時(shí)間，還可能會(huì)使蛋白質(zhì)擴(kuò)散，條帶變寬 。如果出現(xiàn)條帶彎曲或拖尾的情況，可能是凝膠制備不均勻，就像跑道坑洼不平，影響選手的奔跑；也可能是緩沖液離子強(qiáng)度不對(duì)，需要重新檢查緩沖液的配方并新鮮配制。
轉(zhuǎn)膜：蛋白轉(zhuǎn)移的精細(xì)操作
轉(zhuǎn)膜是 Western Blot 實(shí)驗(yàn)中不可或缺的關(guān)鍵步驟，它肩負(fù)著將在凝膠中分離的蛋白質(zhì)精準(zhǔn)轉(zhuǎn)移到固相膜上的重任，為后續(xù)的抗體檢測(cè)搭建起關(guān)鍵的橋梁。轉(zhuǎn)膜的原理基于蛋白質(zhì)的帶電特性，在電場(chǎng)的強(qiáng)大驅(qū)動(dòng)下，帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)從凝膠有序地遷移至膜上 。這一過(guò)程就像是一場(chǎng)精心策劃的搬遷行動(dòng)，讓蛋白質(zhì)從凝膠這個(gè) “臨時(shí)住所” 順利轉(zhuǎn)移到膜這個(gè) “新家”，并且在轉(zhuǎn)移過(guò)程中，蛋白質(zhì)能夠保持其在凝膠中的相對(duì)位置和分辨率，為后續(xù)的抗體識(shí)別和檢測(cè)奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
在轉(zhuǎn)膜方法的選擇上，主要有濕轉(zhuǎn)、快速濕轉(zhuǎn)和半干轉(zhuǎn)這幾種主流方式。常規(guī)濕轉(zhuǎn)，如同一場(chǎng)在 “水世界” 里的轉(zhuǎn)移之旅，通過(guò)制作 “海綿墊 - 濾紙 - 膜 - 凝膠 - 濾紙 - 海綿墊” 這樣的三明治夾板結(jié)構(gòu)，放入充滿轉(zhuǎn)膜緩沖液的轉(zhuǎn)膜槽中，在電場(chǎng)力的強(qiáng)力作用下，蛋白質(zhì)從凝膠緩緩轉(zhuǎn)移到膜上 。它的優(yōu)點(diǎn)十分顯著，轉(zhuǎn)膜效果極為完全，就像搬家時(shí)所有物品都能被妥善安置，因此應(yīng)用廣泛，是眾多科研人員的常用之選。然而，常規(guī)濕轉(zhuǎn)也存在一些小缺點(diǎn)，所需時(shí)間較長(zhǎng)，就像一場(chǎng)漫長(zhǎng)的搬家過(guò)程，可能會(huì)耗費(fèi)較多的時(shí)間和耐心。而快速濕轉(zhuǎn)能在一定程度上解決時(shí)間長(zhǎng)的問(wèn)題，比如中科通儀就有相關(guān)的快速濕轉(zhuǎn)設(shè)備，能夠滿足一些對(duì)時(shí)間有更高要求的實(shí)驗(yàn)場(chǎng)景 。半干轉(zhuǎn)則與濕轉(zhuǎn)有所不同，它在固定膠 / 膜疊層及施加電場(chǎng)的儀器上另辟蹊徑。其優(yōu)點(diǎn)是轉(zhuǎn)膜速度較快，能夠在較短的時(shí)間內(nèi)完成蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移，就像一場(chǎng)高效的快速搬家。但它也有不足之處，對(duì)于某些蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)膜效率可能略低于濕轉(zhuǎn)，在轉(zhuǎn)移過(guò)程中可能會(huì)出現(xiàn)一些小狀況，導(dǎo)致部分蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移效果不夠理想。
在轉(zhuǎn)膜過(guò)程中，有諸多注意事項(xiàng)需要我們格外關(guān)注。膜的選擇至關(guān)重要，Western Blot 實(shí)驗(yàn)中常用的轉(zhuǎn)印膜主要有 PVDF 膜（聚偏二氟乙烯膜）和 NC 膜（硝酸纖維素膜） 。PVDF 膜機(jī)械強(qiáng)度高，化學(xué)相容性好，靈敏度高，分辨率和蛋白親和力都很出色，尤其適合分子量較小的蛋白質(zhì)檢測(cè)，就像一把精準(zhǔn)的 “小蛋白探測(cè)器”。不過(guò)，它通常需要用甲醇 / 乙醇預(yù)先活化，在使用前需要多一道準(zhǔn)備工序。NC 膜則背景低，可結(jié)合蛋白質(zhì)和核酸進(jìn)行各種印跡應(yīng)用，是一種較為經(jīng)濟(jì)實(shí)用的選擇 。但它對(duì)于分子量較小的蛋白質(zhì)在洗滌時(shí)容易丟失，且韌性較差，操作時(shí)需要格外小心，否則容易破碎。在選擇膜時(shí)，還需要考慮膜的孔徑大小。通常，Western Blot 轉(zhuǎn)印膜有 0.2μm 和 0.45μm 兩種孔徑 。0.2μm 的膜如同一張細(xì)密的濾網(wǎng)，更適合小于 20kD 的蛋白或低豐度蛋白的檢測(cè)；而 0.45μm 的膜則像是一張普通的濾網(wǎng)，更常用，適合大于 20kD 的蛋白。
在操作過(guò)程中，要小心避免氣泡的產(chǎn)生。氣泡就像隱藏在轉(zhuǎn)膜過(guò)程中的 “小搗蛋”，會(huì)阻礙蛋白質(zhì)的正常轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致轉(zhuǎn)膜不均勻，出現(xiàn)條帶缺失或變形等問(wèn)題。我們可以在組裝轉(zhuǎn)膜三明治結(jié)構(gòu)時(shí)，用玻璃棒輕輕滾動(dòng)，將氣泡趕出，確保蛋白質(zhì)能夠順利轉(zhuǎn)移。
溫度的控制也不容忽視。轉(zhuǎn)膜過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生熱量，如果溫度過(guò)高，就像給蛋白質(zhì) “蒸桑拿”，可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，影響后續(xù)的檢測(cè)結(jié)果。我們可以使用冰袋或凝膠狀冷卻包來(lái)提供有效的降溫，讓蛋白質(zhì)在一個(gè)舒適的 “溫度環(huán)境” 中完成轉(zhuǎn)移。
電極方向的正確性也至關(guān)重要。如果電極方向接反，就像指南針指錯(cuò)了方向，蛋白質(zhì)不僅無(wú)法順利轉(zhuǎn)移，還可能會(huì)反向遷移，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。所以在轉(zhuǎn)膜前，一定要仔細(xì)檢查電極方向，確保萬(wàn)無(wú)一失。
免疫檢測(cè)：精準(zhǔn)識(shí)別目標(biāo)蛋白
免疫檢測(cè)是 Western Blot 實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，它就像一場(chǎng)精準(zhǔn)的 “蛋白質(zhì)識(shí)別游戲”，利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理，從眾多蛋白質(zhì)中精準(zhǔn)地找出目標(biāo)蛋白。這一過(guò)程就像是在茫茫人海中尋找特定的某個(gè)人，而抗體就是那把獨(dú)一無(wú)二的 “鑰匙”，能夠準(zhǔn)確地開(kāi)啟目標(biāo)蛋白這把 “鎖” 。
在免疫檢測(cè)過(guò)程中，封閉是重要的第一步。封閉的目的是用無(wú)關(guān)蛋白填充膜上的空白位點(diǎn)，防止抗體非特異性結(jié)合，就像用填充物填滿房間的空隙，讓抗體只能與目標(biāo)蛋白結(jié)合 。常見(jiàn)的封閉液有 5% 脫脂奶粉和 3% BSA（牛血清白蛋白）。對(duì)于一般的蛋白質(zhì)檢測(cè)，5% 脫脂奶粉是經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的選擇；而在檢測(cè)磷酸化蛋白時(shí)，由于奶粉中含有酪蛋白（一種磷酸化蛋白），可能會(huì)導(dǎo)致背景信號(hào)過(guò)高，所以更推薦使用 3% BSA 作為封閉液 。
抗體孵育是免疫檢測(cè)的核心步驟。一抗是與目標(biāo)蛋白特異性結(jié)合的抗體，它的濃度和孵育時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有著至關(guān)重要的影響?？贵w濃度過(guò)高，就像在房間里放了太多的人，可能會(huì)導(dǎo)致非特異性結(jié)合增加，背景信號(hào)增強(qiáng)；抗體濃度過(guò)低，則可能會(huì)使目標(biāo)蛋白無(wú)法被充分識(shí)別，信號(hào)變?nèi)? 。孵育時(shí)間也需要根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整，一般來(lái)說(shuō)，室溫孵育 1 - 2 小時(shí)或者 4℃過(guò)夜孵育都是常見(jiàn)的選擇。4℃過(guò)夜孵育雖然時(shí)間較長(zhǎng)，但可以讓抗體與目標(biāo)蛋白充分結(jié)合，提高檢測(cè)的靈敏度 。二抗是與一抗結(jié)合的抗體，它通常帶有標(biāo)記物，如辣根過(guò)氧化物酶（HRP）或熒光素，用于后續(xù)的信號(hào)檢測(cè)。二抗的選擇要與一抗的來(lái)源物種相匹配，比如一抗是小鼠來(lái)源的，二抗就應(yīng)該選擇抗小鼠的抗體 。
洗膜是免疫檢測(cè)過(guò)程中不可或缺的步驟，它的作用是去除未結(jié)合的抗體和雜質(zhì)，確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。洗膜時(shí)要使用合適的洗膜液，如 TBST（Tris 緩沖鹽溶液加 Tween - 20）或 PBST（磷酸鹽緩沖鹽溶液加 Tween - 20） 。Tween - 20 是一種非離子表面活性劑，能夠降低表面張力，幫助去除非特異性結(jié)合的抗體 。洗膜次數(shù)一般為 3 - 5 次，每次 5 - 10 分鐘。洗膜不充分，就像衣服沒(méi)洗干凈，會(huì)殘留未結(jié)合的抗體，導(dǎo)致背景信號(hào)過(guò)高；洗膜過(guò)度，則可能會(huì)洗去部分與目標(biāo)蛋白結(jié)合的抗體，使信號(hào)減弱 。在洗膜過(guò)程中，要注意輕輕晃動(dòng)容器，讓洗膜液充分接觸膜的表面，確保洗膜效果均勻一致。
總結(jié)
Western Blot 實(shí)驗(yàn)全流程涵蓋了樣本制備、凝膠制備、電泳、轉(zhuǎn)膜以及免疫檢測(cè)等多個(gè)關(guān)鍵步驟，每一個(gè)步驟都如同精密儀器中的一個(gè)部件，任何一個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)偏差，都可能影響整個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。從樣本制備時(shí)對(duì)裂解液的謹(jǐn)慎選擇，到凝膠制備中對(duì)濃度、聚合時(shí)間的嚴(yán)格把控；從電泳時(shí)對(duì)蛋白上樣量和電壓的精準(zhǔn)調(diào)控，到轉(zhuǎn)膜時(shí)對(duì)膜的類型、孔徑以及轉(zhuǎn)膜條件的細(xì)致考量；再到免疫檢測(cè)中對(duì)封閉液、抗體孵育和洗膜的精心操作，每一處細(xì)節(jié)都承載著實(shí)驗(yàn)成功的希望。
在實(shí)際操作中，大家要充分理解每個(gè)步驟的原理和要點(diǎn)，嚴(yán)格按照規(guī)范進(jìn)行操作，并且不斷積累經(jīng)驗(yàn)，根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蜆颖咎攸c(diǎn)，靈活調(diào)整實(shí)驗(yàn)條件。只有這樣，我們才能在這個(gè)充滿挑戰(zhàn)的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，獲得準(zhǔn)確、可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。希望大家在今后的科研道路上，通過(guò)不斷地探索和實(shí)踐，能夠熟練掌握 Western Blot 實(shí)驗(yàn)技術(shù)，為科研工作的順利開(kāi)展奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，在蛋白質(zhì)研究的領(lǐng)域中收獲更多的成果。
